VIRUSI PČELA I VAROA - DESTRUKTIVNI
MEHANIZMI – mr.sc. Violeta Santrač dr.vet.med.

Problematika pčelinjih bolesti predstavlja važno mjesto u suvremenom komercijalnom pčelarenju. Posebice se to odnosi na spoznaju da se unatrag nekoliko desetljeća značajno povećao broj uzročnika bolesti. Također smo svjedoci sve veće povezanosti između pojedinih bolesti pčela koje u zajedničkom nastupu mogu uzrokovati velika uginuća pčelinjih zajednica. Međunarodni transport, izvoz ili uvoz  pčela i/ili njihovih proizvoda povećao je  mogućnost unošenja različitih uzročnika (nametnika, bakterija, gljivica ili virusa) u pčelinje zajednice. Pravilno utvrđivanje bolesti pčela omogućava  odgovarajuće postupke i mjere suzbijanja. Stoga će se učinak ljekovitog sredstva ogledati u neposrednom djelovanju na   uzročnika i posredno na prisustvo neželjenih rezidua u pčelinjim proizvodima.  Briga za ljudsko zdravlje, pojačana kontrola namirnica i strogi veterinarsko-sanitarni propisi odredili su smjer  suvremene poljoprivredno-stočarske proizvodnje. U potpunosti je jasno da bi osvajanje pčelarskog  tržišta  samo na osnovi tradicije  bio prilično nerazborit pokušaj. Uključivanjem ekoloških parametara u proizvodnju osiguravamo pčelarima  ravnopravnu borbu s oštrom konkurencijom koja će vladati unutar EU. Problem rezidua u pčelinjim proizvodima morati će se rješavati u okviru Kodeksa “Dobre pčelarske prakse”u kojima su jasno određeni  zahtjevi  u provedbi zdravstvene  zaštite pčelinjih zajednica. Svako odstupanje od dozvoljenih i točno usmjerenih metoda zaštite predstavljati će rizik za  pčelarstvo koje veoma lako može postati ugrožena djelatnost  ukoliko se naruši ugled  meda kao zdravog dodatka prehrani ljudi.Tko bi rekao, prije dva-tri desetljeća ,da će jedna mala grinja,  “teta varoa” napraviti kaos u svjetskom pčelarstvu. U početku smo mislili da je jednadžba, u kojoj su na jednoj strani pčelari i znanstvenici , a na drugoj strani varoa, veoma lagano rješiva.  Međutim,  s vremenom smo uvidjeli da u toj jednadžbi ima mnogo više nepoznanica. Poglavito se to odnosilo na nejasnu strategiju suzbijanja bolesti  kao i  na značenju varoe u nastanku drugih pčelinjih bolesti. Poremećaj u homeostazi (ravnoteži) pčelinje zajednice počeo je dobrom prilagodbom varoe na novu europsku pasminu pčele uzrokujući pri tome mnoštvo neželjenih učinaka. Primjerice, sisanjem hemolimfe u kukuljica i odraslih pčela, varoa uzrokuje  morfološke i imunološke poremećaje koji stvaraju uvjete za prijenos različitih vrsta uzročnika neovisno o tome da li su oni obligatno ili fakultativno patogeni. Sve do sedamdesetih  godina prošlog stoljeća  problem virusnih infekcija u pčela nije privlačio pažnju pčelarske javnosti.  Razlog tome treba tražiti u relativno prostim dijagnostičkim procedurama koje po senzitivnosti specifi  čnosti dokaza nisu bili u mogućnosti sasvim doprinijeti točnoj dijagnostici virusnih infekcija. Stoga je bilo logično za očekivati da je svega nekoliko laboratorija u svijetu istraživalo viruse  u pčela.
U početku su  se istraživanja  najviše provodila u Engleskoj i  SAD-u, a kasnije u Švedskoj, Austriji, Mađarskoj, Italiji, Francuskoj i Poljskoj . Također, niti u jednom veterinarskom institutu u bivšoj državi  nije provođena  sustavna laboratorijska dijagnostika virusnih bolesti pčela. Naime, tadašnji instituti nisu posjedovali metodologiju izolacije niti serološke identifi  kacije virusa pčela pa su se cjelokupna znanja o klinici iznenadnih većih ili manjih gubitaka u pčelinjacima olako pripisivala virusima, najčešće virusu akutne i kronične paralize ili pak virusu mješinastog legla. Siromašni literaturni podaci uglavnom su se svodili na prevode stranih autora, a udžbenici iz kojih su učili budući doktori veterinarske medicine su oskudno i loše opisivali  komplekse virusnih bolesti pčela. Veoma često su se dijagnoze  uginuća pčelinjih zajednica jednostavno laboratorijski zbrajale i oslanjale na  osnovne, lako izvodive metode i lakše prihvatljive odgovore o mogućim uzrocima. Tako se, nažalost, u skladu s (ne)mogućnostima u utvrđivanju dokaza tumačila i relativna istinitost nalaza. Danas, u modernim uvjetima dijagnostike, virusne bolesti pčela imaju značajno mjesto. Unatoč  velikom broju znanstvenih radova iz tog područja te  spoznaji da je do danas izolirano dvadesetak virusa pčela , mi još uvijek ne možemo točno utvrditi koliko su oni važni u patologiji pčela. Nesporno je da su virusne bolesti pčela doživjele u posljednje vrijeme više promjena negoli sve druge spoznaje o pčelinjim bolestima zajedno te da su vjerojatno virusi odgovorni za zbrku  i greške nastale u dijagnostici i menadžmentu bolesti pčela. Očit slučaj za to je povijest bolesti paralize pčela. Činjenica jest da se malo  zna o epidemiologiji ili epizootiologiji virusnih bolesti pčela.  U prilog ovome ide i činjenica da se OIE (Svjetska organizacija za zaštitu zdravlja životinja) još uvijek nije ohrabrila povesti ozbiljne rasprave  kako bi virusne bolesti pčela trebale biti na popisu naročito opasnih bolesti pčela. Pitanje je vremena kada će se u kodu kojim se regulira promet pčelama i pčelinjim proizvodima virusne bolesti spomenuti u kontekstu manje poželjnih nalaza kojim se isključuje ili potvrđuje međunarodna trgovina. Do tada, moramo što više učiti i proširivati svoja saznanja  o virusnim bolestima pčela kako bi ovladali dijagnostičko kliničkim metodama za raspoznavanje ove grupe bolesti. Filogenetske analize, učestale pretrage pčelinjaka na nivou država ili regija, udruženja poput BRAVE (Bee Research and Virology in Europe) u Fp 6 s temama:  virusi pčela i njihove  osobine, dijagnostičke procedure, virusne infekcije pčela i genetske osnove, imunologija, ponašanje pčela, supstrat patološkog procesa, latentnost virusnih infekcija, menadžment bolesti, ekonomski značaj infekcija i mjere zaštite od unošenja i širenja virusnih infekcija samo su dio interesa EU s ciljem da se sumira sveukupno znanje iz virologije kukaca kako bi se moglo zaštititi pčele i ostale oprašivače te da se predloži radni okvir za daljnja istraživanja u tom području. Prvi opis filtrabilnog( virusa ) agensa u beskralježnjaka dao je White 1913.g za uzročnika mješinastog legla (SBV). Kasnije,1940. godine isti virus je elektronski utvrđen. Istraživanja na području virusa pčela miruju do 1964.god. kada se dokazuje uzročnik akutne i kronične paralize pčela (ABPV, CBPV). Četrdesetogodišnji razvoj u taksonomiji virusa A. mellifera, od tzv. malih RNK virusa, kasnije nazvanih Picornaviridae nastavlja se i danas primjenom molekularno-bioloških metoda dokaza sličnosti genoma različitih genetskih grananja virusa pčela u tijeku tzv. ekotip vrsta prilagodbe. Picorna like bee viruses povezani s beskralježnjacima  svrstani su danas u grupe, superfamilije kao:  Calciviridae, Comoviridae, Picornaviridae, Potyviridae, Sequiviridae. Svi pčelinji virusi (oko dvadeset različitih virusa), građeni su od jednostrane RNK m 20-30 nm u dijametru, izometričnog oblika bez kapsida. Razlika ovome je samo građa fi  lamentoznih pčelinjih virusa. Viruse  pčela je veoma teško pojedinačno razlikovati koristeći  kriterije fizičkih karakteristika. Veoma često se pojavljuje da veći broj različitih pčelinjih virusa koegzistira u formi nevidljive (inaparentne) infekcije te je nemoguće prepoznati kliničku sliku virusnih infekcija samo na osnovi terenskih ispitivanja. Molekularne tehnologije su veoma učinkovit alat za specifi čno, senzitivno i brzo utvrđivanje virusa pčela. Činjenica da su genomi nekih virusa pčela u potpunosti se kvencionirani (GenBank Accesion), čine molekularnu detekciju i svojstvenost tih virusa mogućim koristeći RT-PCR metodu. Viruse je moguće dokazati u različitim životnim stadijima pčela, na nivou različitih organa i tkiva. Također, koristeći ovu metodu moguće je dokazati viruse  kod varoe  koja u slučaju ovakvih infekcija predstavlja idealni  biološki vektor. Na osnovu stečenih znanja s Apimondija održanih 2003.g. u Ljubljani i 2005.g. u Dablinu, te novije stručne literature pokazala se realna potreba da se rutinska dijagnostika bolesti pčela  u BiH  proširi na virusne bolesti.  Kako se u dokazu virusnih bolesti pčela koriste sofi  sticirani laboratorijski testovi, sasvim je razumljivo da takva vrsta dijagnostike nije rađena u BiH. Stoga je postojala opravdana potreba za usavršavanjem iz ovog područja. Odlazak na željenu edukaciju u Beltsville Agricultural Research Center, SAD,  omogućio mi je kontrolu uzoraka pčela s različitih područja Bosne i Hercegovine  kao i ovladavanje tehničko- laboratorijskim i praktičnim načinom dijagnostike virusnih bolesti pčela.  Stečena znanja poslužila su u edukaciji veterinara, biologa, agronoma, pčelara i farmaceuta.  U okviru svojih istraživanja ispitivali  smo ,metodom reverzne transkripcije (RT-PCR), šest najčešće dijagnosticiranih virusa pčela : virus akutne paralize pčela (ABPV), virus crne matice ili  virus crnog matičnjaka (BQCV), virus kronične paralize pčela (CBPV), virus deformiranih krila pčele (DWV), kašmirski pčelinji virus (KBV), i virus mješinastog legla (SBV). Princip dokaza virusnog genoma u RT PCR reakciji svodi se na postupak, koji je s manjim optimizacijama protokola izvođen u dva laboratorija:  u SAD-u 2006.g. i u Austriji 2007.g. i 2008.g. godine u kojima su se ispitivali uzorci pčela s područja Bosne i Hercegovine.
Postupak:
Ukupna količina RNK izolirana je iz svake pojedinačne matice ili grupe radilica koristeći RNK-kit za izolaciju (Trizol., Invitrogen, Carslbad., CA) opisan u proizvođačkom protokolu. Uzorci RNK otopljeni su DEPC vodom u nazočnosti ribonukleinskog inhibitora (Invitrogen) i pohranjeni na minus -80°C . Uzorak svakog dobijenog RNK materijala od individualnih matica i u paru ekstrahiranih radilica ispitivan je na prisustvo 6 pčelinjih virusa (ABPV, BQCV, CBPV, DWV, KBV, SBV), metodom RT-PCR (Access RT-PCR, Promega, Madison, WE.). Korišteni primeri bili su veličine od 415 do 900 bp (Invitrogen).Reakcijska mješavina i termo-ciklični profi izvodili su se na način kako je  opisao autor. U testu je korištena negativna kontrola (voda) i pozitivna kontrola (prethodno pozitivno utvrđeni uzorci iz banke BRL) . Dobiveni  PCR produkti su podvrgnuti procesu elektroforeze u 1% agaroznom gelu koji je sadržavao 0,5 μg/ml ethidium bromida. Vizualizacija dobivenih fragmenata provodila se  pod UV svjetiljkom. Da bi se spriječila  mogućnost kontaminacije PCR produkata, reakcija pripreme mastermiksa izvođena je u uvjetima specijalno kreirane komore.  (PLAS, Lansing, MI), a  gel-elektroforeza je izvođena u posebnoj prostoriji.  PCR produkti specifi  čni za svaki virus pročišćavani su korištenjem Wizard PCR-Prep DNA Purifi cation System (Promega, Madison, WI) i bili su sekvencionirani da bi se potvrdila specifi  čnost RT-PCR. Nukleotidne sekvence ovako dobivenih produkata analizirane su i uspoređene sa sekvencama publiciranim u GenBank, National Center for Biotechnology Information, NIH.  Nakon provedenog istraživanja dokazali  smo prisustvo pet različitih virusa pčela na području BiH iz uzoraka zdravih i bolesnih pčelinjih zajednica. To su: virus akutne paralize pčela (ABPV), virus crne matice ili crnog matičnjaka (BQCV), virus kronične paralize pčela (CBPV), virus deformiranih krila pčele (DWV) i virus mješinastog legla (SBV). Na osnovu mišljenja vodećih svjetskih pčelarskih stručnjaka kombinacija različitih faktora i njihovog istovremenog djelovanja može dovesti do masovnih uginuća pčelinjih zajednica. U razumijevanju zdravstvenog statusa pčelinje zajednice ne postoje danas neki univerzalno i jedinstveno prisutni krivci kao što je do sada recimo bila shvaćena infestacija s varozom. Iako se uzroci masovnih uginuća pčelinjih zajednica najčešće opisuju kao posljedica napada varoe, mi još uvijek tražimo odgovore na pitanja u svezi mehanizma patološkog djelovanja varoe na pčelinju zajednicu. Visoka smrtnost pčelinjih zajednica, izražena kao kolaps u periodu kraćem od dvije nedjelje, pripisuje se činjenici da se jaka infestacija s varoom može optužiti kao jedan od uzročnih faktora. Poglavito se to odnosi na pretpostavku da varoa mijenjajući prirodne uvjete homeostaze pčele vjerojatno slabi njen imunološki odgovor. To otvara vrata razvoju različitih virusnih i bakterijskih infekcija pčela koje u konačnici mogu dovesti do velikih pomora pčelinjih zajednica. Jedno od  pitanja danas glasi:  Na koji način varoa može djelovati na imunološke sposobnosti medonosne pčele? U prilog ovome je izvještaj o mogućim uzročnicima prošlogodišnje pošasti u američkom pčelarstvu,  tzv. CCD sindromu i razlozima njegovog nastanka:
1. Virusna infekcija
Stručnjaci Pen State univerziteta ,SAD, odjeljenja za poljoprivredu USDA istraživali su materijal iz pčelinjih zajednica koje su po klasifikaciji odgovarale sindromu CCD-a i molekularno biološkim metodama PCR dekodirali prisutan genetski materijal. U časopisu Science Express od rujna 2007. obznanili su da su iz takvog materijala dokazali prisustvo izraelskog virusa akutne paralize pčela (IAPV) koji je bio prisutan u više od 90% uzoraka dokazujući da je ovaj virus dobar biološki marker ako ne i glavni uzrok CCD-a. Druga grupa znanstvenika koja je surađivala s američkim vojnim stručnjacima, također je radila dijagnostiku iz uzoraka CCD-a sumnjivih zajednica i nije uspjela pronaći poveznicu s virusom IAPV. Virus IAPV po tvrdnjama stručnjaka došao je iz Australije iako tamo nije bilo izvještaja o poremećajima koji bi sličili na CCD.
2. Varroa destructor - infestacija kao uzrok CCD-a
Iako ugriz varoe ne ubija pčelu, on na njenom tijelu ostavlja oštećenja u tipu ubodnih rana koje su onda idealna vrata infekcije. Trahealna grinja je jedan od mogućih uzročnika jer izaziva patološke promjene na nivou trahealnog stabla. No, i pored svega postavlja se pitanje zašto bi varoa bila danas više patogena nego prije i zašto u se u tom slučaju CCD-a nije pojavio prije 2006 godine? Moguće je da varoa u svom djelovanju slabi imunološke snage organizma sve dok i najbanalniji ubikvitarni (uvijek i sve prisutan) uzročnik ne dovede do uginuća pčele. Međutim, dodatnu zbrku je uzrokovala tvrdnja da su mnoge zajednice bile slobodne od varoe, a ipak da su pretrpjele CCD gubitke.Još jednom se pokazalo da ne postoje jednostavni crno- bijeli odgovori u razumijevanju dijagnostike , patologije, epidemiologije i ekologije pčela. Zdravlje, odnosno bolest može biti kombinacija različitih čimbenika. Što će se od prepoznatog zaista proglasiti za realnog krivca tj. uzročnika, ovisi od kreativnosti i mogućnosti dijagnostičkog laboratorija ili znanja i vještine pčelara pojedinačno. Danas je teško tvrditi da se neki zahtjevi u selekcijskom radu, a koji se odnose na propisano zakonodavstvo mogu dovesti u zdravo razumsko tumačenje. Kako zahtijevati da se npr. selekcionirane matice deklariraju kao slobodne od nozemoze ili neke bakterijske bolesti kada se najveći znanstveni centri još uvijek naporno trude shvatiti suštinu odnosa između svakog pojedinačnog uzročnika i svih njih u korelaciji.  Svaka tvrdnja o samo jednom uzročniku zdravlja ili bolesti  pčelinje zajednice (unutar svih njenih kasta) može  se smatrati kao  neozbiljno tumačenje . Teško je reći kako se zdravstvena zaštita pčela tj. njihov zdravstveni status uklapa u vrijednosti nečega što se deklarira kao genotip-fenotip poželjna varijanta. Glavni pravci selekcije pčela u svijetu idu u pravcu selekcije na otpornost prema bolestima što nikako ne treba izgubiti iz vida u uvjetima trenutne selekcije pčela kao i činjenici da je otpornost prema virusnim infekcijama vjerojatno i genetski predisponirana.